对象与方法

一、对象

选取2020年1月1日至2022年8月26日于郑州大学第一附属医院确诊的DLBCL患者1 790例，其中202例为初诊即侵犯骨髓者；初诊侵犯骨髓病例中骨髓涂片形态学资料完整者79例，男49例，女30例，年龄58（30，82）岁。筛选本院同期30例未侵犯骨髓的初诊DLBCL患者作为对照，男14例，女16例，年龄53（27，77）岁，患者一般临床信息见表1。本研究经郑州大学第一附属医院医学科研伦理委员会批准（2021-KY-1132-002），所有研究对象均知情同意。

二、方法

1.采集患者临床信息：包括性别、年龄、是否具有B症状、脾肿大、肝肿大、结外受累器官数、组织病理非特指类型、临床分期、国际预后指数等。

2. 骨髓涂片检测和骨髓活检检测：采集初诊即侵犯骨髓的DLBCL患者的骨髓液或骨髓组织，进行骨髓涂片检测和骨髓活检检测。骨髓涂片经瑞-吉氏染色后，油镜下观察DLBCL的胞体、胞浆、胞核等形态特征、低倍镜下观察是否存在噬血现象和瘤细胞聚集现象。DLBCL形态学特征的判断以正常原、幼、成熟淋巴细胞作为参照标准，排除治疗对瘤细胞形态的影响，形态学特征包括细胞大小、形状、胞浆量、胞浆内空泡、胞浆颜色、浆质体、核周淡染区、伪足、胞核大小、胞核形状、胞核数量、核仁大小、核仁数量、瘤细胞聚集现象、噬血细胞现象等。其中，胞体大小：“小”即淋巴细胞大小；“中等”即淋巴细胞的2倍；“大”即大于淋巴细胞2倍；胞浆量：“少量”相当于小淋巴细胞胞浆量；“中等量”相当于大淋巴细胞胞浆量；“大量”相当于或大于异型淋巴细胞胞浆量；染色质：根据正常淋巴细胞发育分为“细致疏松”“粗糙”；核仁大小：以正常原始淋巴作为参照，分为“小”“中等大小”“大而明显”；核仁数量：以正常原始淋巴核仁数为基线，分为0、1~2、≥3个。此外，将骨髓涂片中DLBCL瘤细胞的比例按其表达量分为DLBCL低表达组（比例：0~20%）和高表达组（比例：≥20%）。

3.流式细胞术分析：经过裂解红细胞、抗体标记、洗涤，分析骨髓中DLBCL细胞表达CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD38、CD79b、CD200、ki-67、FMC7、Kappa、Lambda、HLA-DR、PD-1、PDL-1的情况；同时根据CD3、CD4、CD8、CD16、CD56分析T细胞亚群和NK细胞的含量。

4.疾病预后指标的选取：以30例非侵犯骨髓的DLBCL患者为对照，选取R-CHOP和CHOP化疗3周期以上的初诊DLBCL病例，筛选影响DLBCL的无进展生存期（progression free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）的骨髓涂片形态学指标。PFS是从患者诊断至进展、发生任何原因死亡或随访结束的时间；OS是从患者诊断至死亡或随访结束的时间，两者均是评估预后的指标。

三、统计学分析

统计学分析采用SPSS 26.0软件。呈正态分布的定量资料采用均数±标准差描述；分类资料的采用例（%）描述，采用检验或Fisher确切概率检验。骨髓涂片中DLBCL的比例与胞体大小、胞浆量及与Ann Arbor分期的相关性分析采用Spearman秩相关。

采用二分类Logistic回归模型，在调整混杂变量的影响后，分析骨髓片中DLBCL细胞检出与否与患者临床特征的B症状、结外器官受累数、临床分期的相关性。采用二分类Logistic回归模型或有序多分类Logistic回归模型，检验DLBCL形态特征与流式细胞术参数的相关性。

生存资料分析中，采用Kaplan-Meier法作生存曲线，log-rank检验比较两组生存曲线的差异；采用多因素Cox回归模型，在调整混杂因素的影响后，分析DLBCL及其数量对患者预后的影响。

检验水准均α=0.05（双侧）。

结果

一、DLBCL侵犯骨髓阳性率

排除转化淋巴瘤、治疗相关性DLBCL、DLBCL合并其他肿瘤等情况，1 790份初诊DLBCL中骨髓涂片DLBCL细胞阳性92份（5.14%），骨髓活检DLBCL细胞阳性87份（4.86%），骨髓流式DLBCL细胞阳性166份（9.27%）。存在同一患者同时进行骨髓涂片、活检和流式细胞术3项的2项检查。

二、DLBCL形态学特征

初诊79例骨髓涂片中DLBCL细胞形态特征：胞体多为等于或大于2倍体积的淋巴细胞（图1），形态各异、圆形或类圆形或不规则形（图2），47例（59.50%）中可见伪足或突起（图3）；胞浆量中等，49例（62.03%）可见空泡（图4），11例（13.92%）可见核周淡染区；细胞核形态各异，圆形或类圆形或不规则形（图2），以1个为主，14例（17.72%）可见多核（图5），染色质细致疏松，40例（50.63%）核仁中等大小，17例（21.52%）大而明显（图6），核仁以1~2个为主，18例（22.78%）核仁数超过2个（图7）；32例（40.51%）可见浆质体，22例（27.85%）可见噬血现象，14例（30.38%）瘤细胞聚集现象，3例（3.80%）可见病理分裂象（图8）。

图1  骨髓涂片中DLBCL细胞大小不一（1A为瘤细胞体积小；1B为瘤细胞体积大；1C为同一瘤细胞体积大小不一；瑞-吉染色 ×1 000）

图2  骨髓涂片中DLBCL胞体和胞核形态各异（2A瘤细胞呈不规则形；2B瘤细胞呈类圆形；2C瘤细胞呈梭形；瑞-吉染色　×1 000）

图3  骨髓涂片中DLBCL细胞的伪足或突起（3A仅1个瘤细胞可见伪足；3B所有瘤细胞可见伪足；3C瘤细胞可见突起；瑞-吉染色　×1 000）

图4  骨髓涂片中DLBCL细胞的胞浆空泡（4A瘤细胞胞浆可见少量空泡；4B瘤细胞胞浆可见中等量空泡；4C瘤细胞胞浆可见大量空泡；瑞-吉染色　×1 000）

图5  骨髓涂片中DLBCL细胞中的多个细胞核（5A瘤细胞可见2个胞核；5B瘤细胞可见4个胞核；5C瘤细胞可见6个胞核；瑞-吉染色　×1 000）

图6  骨髓涂片中DLBCL细胞核中的大核仁（6A瘤细胞内核仁大而明显；6B瘤细胞内核仁大而明显；6C瘤细胞内核仁体积中等大；瑞-吉染色　×1 000）

图7  骨髓涂片中DLBCL细胞核中的多个核仁（7A瘤细胞内有3个以上核仁；7B瘤细胞内有4个以上核仁；7C瘤细胞内有2个以上核仁；瑞-吉染色　×1 000）

图8  DLBCL骨髓涂片中的浆质体、噬血现象、瘤细胞聚集现象和病理分裂象（8A为浆质体，瑞-吉染色 ×1 000；8B为噬血现象，瑞-吉染色 ×1 000；8C为瘤细胞聚集现象，瑞-吉染色 ×200；8D为瘤细胞病理分裂象，瑞-吉染色 ×1 000）

Spearman秩相关分析结果显示，骨髓涂片中DLBCL比例与胞体大小（r_s=0.05，P=0.279）、胞浆量（r_s=0.05，P=0.236）无相关性，与Ann Arbor分期相关（r_s=0.630，P<0.001）。按骨髓涂片中DLBCL的比例将其表达量分为DLBCL低表达组（比例0~20%）和高表达组（比例≥20%），两组间胞体形状（χ²=3.185）、浆质体（χ²=0.009）、核周淡染区（χ²=0.137）、胞浆空泡有无（χ²=0.312）、胞浆伪足（χ²=2.167）、胞核数量（χ²=0.412）、胞核形状（χ²=3.125）、核仁大小（χ²=0.035）、核仁数量（χ²=0.004）差异均无统计学意义（P>0.05）。

三、特殊病例分析

在79例初诊DLBCL中有5例瘤细胞为轻度变异型（图9）：其体积较小，胞体圆形或类圆形；胞浆量少、其中2例可找见突起；胞核圆形或类圆形、其中1例偶见多核、染色质较粗糙聚集、核仁隐显不一；其中1例可见噬血现象（图9）。这5例DLBCL在形态学上类似于淋巴细胞，容易误诊，最终结合免疫分型（流式细胞术）和骨髓活检确诊为DLBCL。

图9  骨髓涂片中轻度变异型DLBCL细胞（瑞-吉染色　×1 000）

四、骨髓涂片中DLBCL形态与肿瘤微环境、临床特征的关系

1. 骨髓涂片检出DLBCL细胞结果：以骨髓涂片中是否检出DLBCL细胞（1=是，0=否）为因变量，以患者的年龄、临床分期（1=Ⅰ，2=Ⅱ，3=Ⅲ，4=Ⅳ）和结外受累器官数（1≤2个，2≥2个）为自变量进行Logistic回归分析显示，在调整其他自变量的影响后，骨髓中DLBCL细胞的存在与患者年龄、临床分期、结外受累器官数相关（OR=7.480、15.705、7.596，P均<0.05），见表2。

2. DLBCL细胞形态结果：分别以骨髓涂片中瘤细胞大小（1=大，2=中等，3=小）、胞浆量（1=少量，2=中等，3=大量）、胞浆是否含有空泡（1=有，2=无）、胞浆以是否有伪足或突起（1=有，2=无）、核仁大小（1=无或小，2=中等或大而明显）、浆质体有无（1=有，2=无）、是否存在噬血现象（1=是，2=否）为因变量，以DLBCL细胞表达CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD38、CD79b、CD200、Ki-67、FMC7、Kappa、Lambda、HLA-DR、PD-1、PDL-1的情况（1为≥20%，2为<20%）、CD3⁺CD4⁺%（1=比例为27%~51%，2=比例>51%或<27%）、CD3⁺CD8⁺%（1=比例为15%~44%，2=比例>44%或<15%）、CD3^-CD16⁺CD56⁺%（1=比例为7%~40%，2=比例>40%或<7%）为自变量进行Logistic回归分析。结果显示：瘤细胞大小与总T淋巴细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4/CD8比值相关；瘤细胞胞浆量与瘤细胞表达CD38有关；瘤细胞胞浆空泡与瘤细胞表达CD38相关；瘤细胞伪足或突起与瘤细胞表达CD38相关；瘤细胞核仁大小与NK细胞数量相关；浆质体与T细胞表达HLA-DR有关；DLBCL中出现的噬血现象与瘤细胞表达CD5、PD-L1有关；瘤细胞聚集分布与CD4/CD8比值相关（P均<0.05，表2）。

五、骨髓涂片中检出DLBCL细胞及其数量在预后价值中的评估

1. 筛选影响DLBCL的PFS的骨髓涂片形态学指标：有DLBCL细胞组的PFS生存曲线明显低于无DLBCL细胞组，Log-rank检验结果显示，两组生存曲线的差异有统计学意义（P<0.001，图10A），将单因素分析中P<0.05的变量纳入多因素Cox回归模型，结果显示（图10）骨髓涂片存在DLBCL细胞与患者预后差相关（RR=7.059，P<0.001），其余形态学指标与患者预后差无相关性（P>0.05）。

图10  骨髓涂片中是否存在DLBCL细胞患者的生存曲线（10A为无进展生存期；10B为总生存期）

2. 筛选影响DLBCL总生存期（OS）的骨髓涂片形态学指标：如图10B所示，有DLBCL细胞组的OS生存曲线明显低于无DLBCL细胞组，Log-rank检验结果显示，两组生存曲线的差异有统计学意义（P<0.001），将单因素分析中P<0.05的变量纳入多因素Cox回归模型，结果显示（RR=5.409，P<0.001），其余形态学指标与患者预后差无相关性（P>0.05）。

讨论

弥漫大B细胞淋巴瘤是一类侵袭性较高的淋巴瘤，可在疾病的初期或进展期侵犯骨髓，此时处于Ann Arbor分期的第Ⅳ期，严重影响患者的治疗和预后^［1，9］。本研究调查了1790例DLBCL患者，其中初诊骨髓活检阳性率为4.86%，骨髓涂片阳性率为5.14%，骨髓活检和骨髓涂片阳性率接近；有文献报告骨髓涂片与活检在评估侵犯骨髓方面具有显著的一致性^［9］，本次调查结果与之相符。因此，在诊断侵犯骨髓时骨髓涂片可以作为骨髓活检的有效补充。在总结DLBCL初诊侵犯骨髓阳性率基础上，本研究以正常淋巴细胞为参照，总结了骨髓涂片中DLBCL形态学特征，即形态异质性强，与文献报道相一致^{［10, 11, 12］}，主要表现为胞体中等或偏大，胞体和胞核形态异质性大，胞浆量以中等量多见、可见空泡、偶见核周淡染区，染色质细致、核仁以1~2个为主、少部分3个以上，部分DLBCL可见浆质体和噬血现象，少部分可见瘤细胞聚集现象，偶见病理分裂象。因此，在骨髓涂片中发现体积偏大、含有核仁、或具有浆质体或噬血现象等伴瘤现象时，不应忽视DLBCL细胞的存在。此外本研究还发现5例DLBCL，其形态类似于原、幼淋巴细胞，提示在骨髓涂片阅片过程中不要忽视体积较小、轻度异形性的DLBCL细胞，该类型DLBCL需结合流式细胞术和活检进行综合判断。在骨髓涂片阅片时，遇到上述轻度异形瘤细胞时，一定要综合且慎重地判断。本研究发现骨髓涂片中瘤细胞比例与其形态学指标之间差异无统计学意义，这印证了上文总结的DLBCL细胞形态异质性较大。此外，本研究组还发现骨髓涂片中瘤细胞的比例与Ann Arbor分期相关，提示骨髓涂片中DLBCL百分比可用于临床分期。鉴于正电子发射计算机断层显像技术表现为弥漫受累或骨髓浸润少于10%时会出现假阴性的情况，骨髓涂片在检出低比例和弥漫浸润骨髓的DLBCL细胞方面更具有价值。

DLBCL细胞形态是单个肿瘤细胞的表观特征，其与患者的临床表现是否存在联系？本研究发现骨髓涂片检出DLBCL与患者年龄、临床分期（Ⅲ~Ⅳ期）、结外受累器官（>2个），这与文献报道相一致^［13］。肿瘤微环境在肿瘤的增殖和转移中起重要作用^［3］，流式细胞术通过单克隆荧光抗体可以对瘤细胞上的免疫分子和肿瘤微环境中的免疫细胞数量、状态和功能等进行检测。本研究发现骨髓涂片中DLBCL细胞大小与总T淋巴细胞数量、CD4⁺T细胞数量、CD8⁺T细胞数量、CD4/CD8比值有关；胞浆量、空泡、伪足与DLBCL细胞表达CD38相关；核仁大小与NK数量相关；噬血现象与DLBCL表达CD5和PDL-1相关；浆质体与T淋巴细胞表达HLA-DR相关；瘤细胞聚集现象与CD4/CD8比值相关。由此可见，CD38、CD5、PD-L1、CD4/CD8、T淋巴细胞亚群数量、NK细胞数量、T细胞活化率（HLA-DR表达率）与DLBCL有一定的关系。CD38是一种多功能胞外酶，能催化多种反应，其产生的酶产物是Ca²⁺传递的信使；此外，CD38还参与人类淋巴细胞与内皮细胞的黏附。CD5属于Scavenger受体家族，少部分DLBCL表达CD5、且原发性CD5⁺DLBCL预后较CD5-DLBCL更差^{［14, 15］}。程序性细胞死亡1（programmed cell death，PD-1）是一种T细胞表面受体，PD-1与其配体（programmed cell death legend 1，PD-L1）的结合可以阻断T细胞中的细胞周期进程并抑制细胞因子的产生，且是介导免疫应答的重要检查点。已证实PD-L1在不同类型的实体瘤中表达上调，其与肿瘤浸润和预后不良相关^［6］。Hou 等^［5］研究发现，与健康对照人群相比，新诊断为DLBCL 患者的 CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T 细胞以及 NK 细胞计数均明显减少；与 IPI 0-2分 DLBCL 患者相比，IPI 3-5 分患者的 CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T 细胞以及 NK 细胞计数均有下降的趋势。尽管上述相关性的机制未明，但是本次研究结果为深入探索DLBCL形态特征与肿瘤微环境的关系指明了方向，也为研究DLBCL发病机制和转移机制提供了重要的线索。

国际预后指数（IPI）是临床上应用最广泛的预测指标，但随着美罗华和免疫治疗的应用，IPI评分具有一定的局限性。本研究发现骨髓涂片中检出DLBCL细胞是独立于IPI影响PFS和OS的形态学指标，提示骨髓涂片可以作为筛查DLBCL是否侵犯骨髓的技术，用于疾病预后的判断。本研究还发现骨髓涂片中不同瘤细胞比例的生存率差异无统计学意义，提示骨髓涂片中DLBCL细胞数量变化不影响患者的预后。急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病高表达CD38时，生存期缩短、预后不良^［16］，这与本研究单因素分析发现表达CD38可以影响DLBCL预后的结论相一致；而多因素分析时两种指标在影响预后方面无统计学意义，可能是由于具有免疫分型指标的病例数较少。本研究组接下来将进一步扩大病例数，以期发现更多免疫分型指标与DLBCL预后之间的关系，探索有统计学意义的免疫分型指标影响DLBCL预后的机制。

在方法学方面，骨髓涂片和活检评估DLBCL侵犯骨髓阳性率接近，骨髓涂片可作为活检的有效补充；骨髓涂片中DLBCL异质性较大，有时会出现类似于原、幼淋巴细胞的小DLBCL细胞，易产生误诊，应特别警惕该类型DLBCL。在临床分期和预后方面，骨髓涂片中DLBCL比例与Ann Arbor分期相关，可用于临床分期；骨髓涂片检出DLBCL细胞是独立于IPI影响患者PFS和OS的形态学指标，但瘤细胞数量变化对患者生存率无影响。在肿瘤微环境方面，骨髓涂片中DLBCL形态指标与CD38、CD5、PD-L1、CD4/CD8比值、T淋巴细胞亚群数量、NK细胞数量、T细胞活化率（HLA-DR表达率）有一定的关系，该发现可为深入研究DLBCL形态特征与肿瘤微环境关系、DLBCL发病及转移机制提供重要的线索。