(一)淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析是目前流式细胞术临床应用范围最广泛的项目,可获得淋巴细胞亚群,包括CD3+总T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞(Th)、CD3+CD8+细胞毒性T细胞(Tc)、CD3-CD19+B淋巴细胞和CD3-(CD16+CD56)+NK细胞的相对百分比(%)和细胞绝对值(cells/μl),在临床诊治中发挥了重要作用。国家卫生健康委员会发布的《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[ 19 ](该行标处于修订过程中),以及《流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识(2019版)》[ 20 ]和《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》[ 21 ]等,对此项目的开展及应用具有重要的指导意义。
(二)免疫细胞精细分型
1.淋巴细胞:(1)T细胞:对T细胞的精细分型,根据细胞表面标记区分T细胞,如调节性T细胞(Treg)、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、Th1、Th2、Th9、Th17和Th22[ 22 ],初始(naive)、效应(effector)、效应记忆型(effector memory)和中央记忆型(central memory)亚群、活化细胞亚群等[ 22 , 23 , 24 , 25 ]。(2)B细胞:根据CD27、IgD、CD24、CD38、CD5等表达,可以将B细胞分为不同亚群[ 23 , 26 , 27 , 28 , 29 ]。(3)NK细胞:根据CD16和CD56表达的不同,可以将NK细胞细分为不同亚群 [ 23 , 30 , 31 ]。目前精细分型的方案并未统一, 表1 汇总了文献报道的常见淋巴细胞精细分型方案,可供参考。
2.髓系细胞:(1)粒细胞:根据CD45和SSC,CD13和CD16以及CD66、CD123、CD203c、HLA-DR等的表达不同,可以将粒细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞[ 23 , 30 ]。(2)单核细胞:根据CD45和SSC,CD13、CD14和CD16的表达不同,可以将单核细胞分为不同亚群[ 23 , 30 ]。(3)树突状细胞(dendritic cell,DC):使用系列抗原(lineage:CD3、CD14、CD16、CD19和CD56)排除T细胞、B细胞、NK细胞、单核、粒细胞等,再根据CD123、HLA-DR、CD11c、CD1c、CD141等的不同表达,可以将DC细胞分为不同亚群 [ 23 , 30 , 32 ]。(4)髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC):根据CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD33等指标的表达,可以将MDSC分为3个不同亚群 [ 33 , 34 ]。 表1 汇总了文献报道的常见髓系细胞精细分型方案,可供参考。
(三)白血病免疫表型分析及微小残留病监测
1.白血病免疫表型分析:(1)急性白血病:对于急性白血病免疫分型,2013版《流式细胞术临床应用的建议》[ 1 ]及《四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识(2015年版)》[ 35 ]均有详细介绍。在上述《建议》和《共识》中,对白血病免疫表型分析均主要推荐采取“2步法”,但对于某些跨系别表达的抗原或是混合表型的白血病,可能会因为检测抗原不足导致漏检的现象。国家卫生健康委发布的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗规范(2018年版)》[ 36 ]和《儿童急性早幼粒细胞白血病诊疗规范(2018年版)》[ 37 ],对于急性白血病免疫分型,建议使用多色流式细胞仪,至少检测上述《诊疗规范》提及的35个CD分子,视情况增加更多抗原检测,同时检测的CD分子越多,准确性相对越高。(2)慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)/非霍奇金淋巴瘤:流式细胞术检测的抗原可以参考《流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识(2017版)》[ 38 ]。但是对于B淋巴细胞,由于慢淋/非霍奇金淋巴瘤的细胞可能来源于淋巴结的多个结构部位[如DLBCL分为生发中心型GCB型、非生发中心non-GCB型和活化B细胞样(ABC)型],需注意其免疫表型的多样性[ 39 ];对于T细胞,如出现异常免疫表型或TCRVβ的单克隆,需要与病毒感染等鉴别。(3)霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL):对于HL,因背景含有大量表型相对正常的淋巴细胞,寻找低比例的Reed-Sternberg细胞存在一定困难。Reed-Sternberg细胞在免疫表型上可以表现为CD45-CD30+CD15+CD71+CD40+CD95+CD3-CD19-等免疫学特征,需要与其他一些表达CD30+的肿瘤细胞进行鉴别[ 40 ],多色流式细胞术在HL中具有一定的辅助诊断价值,HL最终诊断需要结合组织病理学。
2.白血病微小残留病(MRD)监测:(1)急性白血病MRD监测:基于白血病相关免疫表型(leukemia-associated immunophenotype,LAIP,根据非白血病细胞的表达背景来定义)和/或细胞“异于正常(different from normal,DFN)”的表型,可以鉴定出异常的细胞群,进行MRD细胞监测[ 41 ]。急性白血病MRD监测可以参考已发表的中国专家共识[ 42 , 43 ]。(2)慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤MRD监测:典型的CLL免疫表型为CD19+CD5+CD23+CD22+CD200+CD43+CD79blow/-且CD10-FMC7-CD103-CD20lowsIgMlow[ 44 ],可用于CLL诊断和MRD监测。上述表型可以通过固定的MRD组合进行监测,推荐方案包括CD5/CD19/CD20/CD38/CD81/CD22/CD79b/CD43等[ 44 , 45 ],需注意美罗华(Rituximab,利妥昔单抗)治疗会使CD20出现假阴性,鉴于CD200在CLL和其他CD5+淋巴瘤如套细胞淋巴瘤中的作用,也可推荐CD200[ 46 ]和CD160[ 47 ]作为CLL的MRD监测指标。对于免疫表型不典型的淋巴瘤等进行MRD监测,需结合其初发时的免疫表型特征。淋巴瘤的分布具有异质性(如可能涉及外周血、骨髓、淋巴结、肝脏、脾脏等),当采样不同时,MRD监测结果可能也不一致。目前,骨髓是使用最广泛的MRD监测标本,但脾脏、肝脏和淋巴结中的MRD监测亦可在疾病复发中起重要作用[ 45 ]。(3)多发性骨髓瘤MRD监测:可参考已经发表的相关共识进行检测[ 42 ]。MRD监测需要获取足够的细胞数,确定检测的最低检出限(limit of detection,LOD)和最低定量限(lower limit of quantification,LLOQ),推荐固定和规律的取样时间进行MRD监测 [ 45 ]。
(四)细胞因子检测
通过流式细胞术检测细胞因子,主要包括2类方法:(1)基于流式微球阵列技术(Cytometric beads array,CBA),可检测血清、血浆或体液等标本中细胞因子水平。其原理为样品中细胞因子与细胞因子抗体预包被的微球及荧光标记检测抗体结合,形成“双抗体夹心”复合物。此方法使用标本量少,2个荧光检测通道可以同时检测多种细胞因子。(2)可检测激活后胞内细胞因子如IFN-γ等表达,用于评估免疫细胞的功能等。此方法需要新鲜肝素抗凝外周血或分离获得的外周血单个核细胞,使用刺激剂激活细胞,并用阻断剂阻断胞内蛋白质转运,使得刺激产生的细胞因子聚集在细胞内。细胞膜抗原染色后,再使用固定破膜剂固定及破膜对胞内细胞因子如IFN-γ等进行染色。
(五)其他临床应用项目
流式细胞术临床应用的部分项目如红细胞和血小板检测、HLA-B27检测、DNA倍体、凋亡、细胞周期和细胞增殖等已经在2013版[ 1 ]做过详尽介绍,CD34+造血干细胞计数、PNH筛选等临床项目,可以参照已经发布的应用指南或专家共识[ 48 , 49 ]。
共识4 对于淋巴细胞亚群检测等项目,建议参照我国已经发布应用指南或专家共识执行;免疫细胞精细分型项目,建议实验室根据自己的仪器配置等,优化方案,依据临床需求有序开展;对于白血病/淋巴瘤免疫表型分析及MRD筛查等项目,建议依据细胞分化谱系、分化阶段的免疫表型特征和白血病相关免疫表型(LAIP)等进行检测和分析。推荐强度:建议执行。