弥漫大B细胞淋巴瘤是一类侵袭性较高的淋巴瘤,可在疾病的初期或进展期侵犯骨髓,此时处于Ann Arbor分期的第Ⅳ期,严重影响患者的治疗和预后[1,9]。本研究调查了1790例DLBCL患者,其中初诊骨髓活检阳性率为4.86%,骨髓涂片阳性率为5.14%,骨髓活检和骨髓涂片阳性率接近;有文献报告骨髓涂片与活检在评估侵犯骨髓方面具有显著的一致性[9],本次调查结果与之相符。因此,在诊断侵犯骨髓时骨髓涂片可以作为骨髓活检的有效补充。在总结DLBCL初诊侵犯骨髓阳性率基础上,本研究以正常淋巴细胞为参照,总结了骨髓涂片中DLBCL形态学特征,即形态异质性强,与文献报道相一致[10, 11, 12],主要表现为胞体中等或偏大,胞体和胞核形态异质性大,胞浆量以中等量多见、可见空泡、偶见核周淡染区,染色质细致、核仁以1~2个为主、少部分3个以上,部分DLBCL可见浆质体和噬血现象,少部分可见瘤细胞聚集现象,偶见病理分裂象。因此,在骨髓涂片中发现体积偏大、含有核仁、或具有浆质体或噬血现象等伴瘤现象时,不应忽视DLBCL细胞的存在。此外本研究还发现5例DLBCL,其形态类似于原、幼淋巴细胞,提示在骨髓涂片阅片过程中不要忽视体积较小、轻度异形性的DLBCL细胞,该类型DLBCL需结合流式细胞术和活检进行综合判断。在骨髓涂片阅片时,遇到上述轻度异形瘤细胞时,一定要综合且慎重地判断。本研究发现骨髓涂片中瘤细胞比例与其形态学指标之间差异无统计学意义,这印证了上文总结的DLBCL细胞形态异质性较大。此外,本研究组还发现骨髓涂片中瘤细胞的比例与Ann Arbor分期相关,提示骨髓涂片中DLBCL百分比可用于临床分期。鉴于正电子发射计算机断层显像技术表现为弥漫受累或骨髓浸润少于10%时会出现假阴性的情况,骨髓涂片在检出低比例和弥漫浸润骨髓的DLBCL细胞方面更具有价值。
DLBCL细胞形态是单个肿瘤细胞的表观特征,其与患者的临床表现是否存在联系?本研究发现骨髓涂片检出DLBCL与患者年龄、临床分期(Ⅲ~Ⅳ期)、结外受累器官(>2个),这与文献报道相一致[13]。肿瘤微环境在肿瘤的增殖和转移中起重要作用[3],流式细胞术通过单克隆荧光抗体可以对瘤细胞上的免疫分子和肿瘤微环境中的免疫细胞数量、状态和功能等进行检测。本研究发现骨髓涂片中DLBCL细胞大小与总T淋巴细胞数量、CD4+T细胞数量、CD8+T细胞数量、CD4/CD8比值有关;胞浆量、空泡、伪足与DLBCL细胞表达CD38相关;核仁大小与NK数量相关;噬血现象与DLBCL表达CD5和PDL-1相关;浆质体与T淋巴细胞表达HLA-DR相关;瘤细胞聚集现象与CD4/CD8比值相关。由此可见,CD38、CD5、PD-L1、CD4/CD8、T淋巴细胞亚群数量、NK细胞数量、T细胞活化率(HLA-DR表达率)与DLBCL有一定的关系。CD38是一种多功能胞外酶,能催化多种反应,其产生的酶产物是Ca2+传递的信使;此外,CD38还参与人类淋巴细胞与内皮细胞的黏附。CD5属于Scavenger受体家族,少部分DLBCL表达CD5、且原发性CD5+DLBCL预后较CD5-DLBCL更差[14, 15]。程序性细胞死亡1(programmed cell death,PD-1)是一种T细胞表面受体,PD-1与其配体(programmed cell death legend 1,PD-L1)的结合可以阻断T细胞中的细胞周期进程并抑制细胞因子的产生,且是介导免疫应答的重要检查点。已证实PD-L1在不同类型的实体瘤中表达上调,其与肿瘤浸润和预后不良相关[6]。Hou 等[5]研究发现,与健康对照人群相比,新诊断为DLBCL 患者的 CD3+、CD4+、CD8+T 细胞以及 NK 细胞计数均明显减少;与 IPI 0-2分 DLBCL 患者相比,IPI 3-5 分患者的 CD3+、CD4+、CD8+T 细胞以及 NK 细胞计数均有下降的趋势。尽管上述相关性的机制未明,但是本次研究结果为深入探索DLBCL形态特征与肿瘤微环境的关系指明了方向,也为研究DLBCL发病机制和转移机制提供了重要的线索。
国际预后指数(IPI)是临床上应用最广泛的预测指标,但随着美罗华和免疫治疗的应用,IPI评分具有一定的局限性。本研究发现骨髓涂片中检出DLBCL细胞是独立于IPI影响PFS和OS的形态学指标,提示骨髓涂片可以作为筛查DLBCL是否侵犯骨髓的技术,用于疾病预后的判断。本研究还发现骨髓涂片中不同瘤细胞比例的生存率差异无统计学意义,提示骨髓涂片中DLBCL细胞数量变化不影响患者的预后。急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病高表达CD38时,生存期缩短、预后不良[16],这与本研究单因素分析发现表达CD38可以影响DLBCL预后的结论相一致;而多因素分析时两种指标在影响预后方面无统计学意义,可能是由于具有免疫分型指标的病例数较少。本研究组接下来将进一步扩大病例数,以期发现更多免疫分型指标与DLBCL预后之间的关系,探索有统计学意义的免疫分型指标影响DLBCL预后的机制。
在方法学方面,骨髓涂片和活检评估DLBCL侵犯骨髓阳性率接近,骨髓涂片可作为活检的有效补充;骨髓涂片中DLBCL异质性较大,有时会出现类似于原、幼淋巴细胞的小DLBCL细胞,易产生误诊,应特别警惕该类型DLBCL。在临床分期和预后方面,骨髓涂片中DLBCL比例与Ann Arbor分期相关,可用于临床分期;骨髓涂片检出DLBCL细胞是独立于IPI影响患者PFS和OS的形态学指标,但瘤细胞数量变化对患者生存率无影响。在肿瘤微环境方面,骨髓涂片中DLBCL形态指标与CD38、CD5、PD-L1、CD4/CD8比值、T淋巴细胞亚群数量、NK细胞数量、T细胞活化率(HLA-DR表达率)有一定的关系,该发现可为深入研究DLBCL形态特征与肿瘤微环境关系、DLBCL发病及转移机制提供重要的线索。